Punto cardine sulla prevenzione e trattamento del Covid-19 è la sua diagnosi attraverso l’esecuzione di un tampone molecolare. Il campione di materiale così ottenuto viene dunque inviato al laboratorio e analizzato secondo una particolare metodica, la rRT-PCR.

Come si effettua diagnosi di Covid-19 con tampone molecolare

Una volta che il campione è stato prelevato, lo stesso viene inviato presso il laboratorio analisi di riferimento dove avviene l’estrazione e la purificazione dell’RNA per la successiva ricerca dell’RNA virale attraverso una metodica molecolare rapida denominata Reverse Real-Time PCR (rRT-PCR).

I reagenti fondamentali per eseguire questo test, ovvero i primer oligonucleotidici e le sonde, sono stati appositamente disegnati su regioni conservate del genoma virale del SARS-CoV-2.

Mediante un processo di retrotrascrizione, il metodo rRT-PCR permette la sintesi di una molecola di DNA a doppio filamento (cDNA) a partire da uno stampo di RNA, cui segue un’amplificazione per Polymerase Chain Reaction (PCR), una tecnica di biologia molecolare che consente la moltiplicazione di frammenti di acidi nucleici dei quali si conoscono le sequenze nucleotidiche iniziali e terminali. Questa amplificazione consente di ottenere in vitro molto rapidamente la quantità di materiale genetico necessaria per l’analisi.

Tecnicamente questa procedura applica una “one-step real-time RT-PCR”, nella quale la retrotrascrizione e l’amplificazione in PCR sono effettuate consecutivamente nella stessa provetta di reazione. L’utilizzo di sonde rende questo test estremamente specifico: il segnale fluorescente viene difatti rilevato solamente in conseguenza dell’appaiamento della sonda alla sequenza bersaglio. Il bersaglio genico, qualora fosse presente nel campione il genoma virale, viene amplificato e intercettato dalla sonda molecolare.

La chimica del saggio si basa sulla quantità di prodotto che viene amplificato ad ogni ciclo termico e dalla quantità di segnale fluorescente che viene accumulato proporzionalmente. La fluorescenza può essere misurata ad ogni stadio dell’amplificazione mediante la visualizzazione in tempo reale sullo schermo collegato allo strumento.

La durata dell’analisi in Real time PCR è di circa 1 ora e 30 minuti, ai quali andranno aggiunti i tempi di estrazione dell’RNA per un totale di circa 4 ore. Inoltre, nel calcolo del tempo necessario per l’esecuzione del test bisogna tenere in considerazione anche il momento di accettazione e preparazione del campione e le fasi di validazione del test e refertazione.